Regulación de la edición de genes usando T

Feb 15, 2024

Naturaleza Plantas (2023)Citar este artículo

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La transformación mediante Agrobacterium tumefaciens es el método predominante utilizado para introducir ADN exógeno en genomas de plantas1,2. El ADN de transferencia (ADN-T) procedente de Agrobacterium puede integrarse como una sola copia o en formas complejas concatenadas3,4, pero los mecanismos que afectan la estructura final del ADN-T siguen siendo desconocidos. Aquí demostramos que la inclusión de secuencias derivadas de retrotransposones (RT) en el ADN-T puede aumentar el número de copias del ADN-T en más de 50 veces en Arabidopsis thaliana. Estas copias adicionales de ADN-T están organizadas en grandes concatémeros, un efecto inducido principalmente por las repeticiones terminales largas (LTR) de las RT que pueden replicarse utilizando repeticiones de ADN que no son LTR. Descubrimos que la concatenación del ADN-T depende de la actividad de las proteínas reparadoras del ADN MRE11, RAD17 y ATR. Finalmente, mostramos que la concatenación de ADN-T se puede utilizar para aumentar la frecuencia de la mutagénesis dirigida y la selección de genes. En general, este trabajo descubre determinantes moleculares que modulan el número de copias del ADN-T en Arabidopsis y demuestra la utilidad de inducir la concatenación del ADN-T para la edición de genes de plantas.

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Los datos generados a partir de este estudio se incluyen dentro de las cifras principales, datos ampliados e Información complementaria. Los datos de secuenciación sin procesar se depositan en NCBI SRA (BioProject PRJNA892619). El análisis de los datos utilizó el genoma TAIR10 de Arabidopsis (https://www.arabidopsis.org/download/index-auto.jsp%3Fdir%3D%252Fdownload _files%252FGenes%252FTAIR10_genome_release) y la lista de 'Familia de genes ortólogos' obtenida de la base de datos Dicots PLAZA 5.0 (https://ftp.psb.ugent.be/pub/plaza/plaza_public_dicots_05/GeneFamilies/genefamily_data.ORTHOFAM.csv.gz). No hay restricciones en la disponibilidad de datos. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Agradecemos a todos los miembros actuales y anteriores del laboratorio Jacob, especialmente a F. Langhammer y G. Villarino, por los reactivos, las discusiones y los consejos; C. Bolick y su personal de Yale por su ayuda con el crecimiento y mantenimiento de las plantas; H. Puchta del Instituto de Tecnología de Karlsruhe por su generosa donación del gen dirigido a los plásmidos binarios utilizados en este trabajo; y Marco Molina y Mayra Molina (Multi-Crop Transformation Facility, Texas A&M University) por generar las plantas de tabaco transgénicas utilizadas en este estudio. Este proyecto fue apoyado por la subvención R35GM128661 de los Institutos Nacionales de Salud (YJ) y el Premio al Nuevo Innovador del Director de los NIH (DP2GM137414 a SW).

Estos autores contribuyeron igualmente: Lauren Dickinson, Wenxin Yuan.

Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, Facultad de Artes y Ciencias, Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Lauren Dickinson, Wenxin Yuan, Chantal LeBlanc, Geoffrey Thomson y Yannick Jacob

Departamento de Genética, Facultad de Medicina de Yale, Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Siyuan Wang

Departamento de Biología Celular, Facultad de Medicina de Yale, Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Siyuan Wang

Centro Oncológico de Yale, Facultad de Medicina de Yale, Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

yannick jacob

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YJ supervisó el estudio y diseñó los experimentos con LD y WY. Todos los experimentos fueron realizados por LD y WY, excepto el trabajo de mutagénesis dirigida (realizado por CL) y los análisis bioinformáticos (realizados por GT). SW diseñó las sondas para los experimentos FISH. YJ y CL escribieron el artículo, con contribuciones de LD y WY.

Correspondencia a Yannick Jacob.

Una solicitud de patente (solicitud de patente n.º 63/481,276, Oficina de Patentes y Marcas de EE. UU., 24 de enero de 2023), con YJ, LD y WY como inventores, relacionada con el uso de secuencias repetitivas y mutaciones genéticas para regular el número de copias del ADN-T y mejorar la edición de genes. Los demás autores no declaran tener intereses en conflicto.

Nature Plants agradece a Avraham Levy, Damon Lisch y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, ADN-qPCR de ALS en plantas Col-0 (sin transformar) y T1 utilizadas para el experimento FISH (panel by Fig. 1e). Los puntos representan muestras de ADN de hojas individuales de la misma planta T1 (n = 4 para Col-0, ONSEN RT #1 y ONSEN RT #2, n = 3 para No RT). Las barras horizontales indican la media. Se muestra SD. b, FISH en núcleos de hojas dirigidos a la secuencia de ADN-T. Los núcleos se tiñeron con DAPI y sondas para ALS (verde) y NPTII (rojo). El experimento FISH se realizó más de 3 veces con resultados similares.

a, ADN-qPCR de ALS en las plantas No RT y ONSEN RT T1 utilizadas para la secuenciación del genoma completo (panel b, Fig. 1f, gy Fig. 3b). b, Diagramas de locus para las inserciones de ADN-T identificadas. Las coordenadas para cada inserción se basan en la anotación TAIR10 y corresponden a los bordes genómicos de Arabidopsis que rodean cada ADN-T identificado. Para cada inserción, las líneas superiores representan una secuencia genómica inalterada con genes anotados (tonos de azul marino). Las flechas rojas representan puntos de inserción. Las líneas inferiores muestran los límites de la inserción con más detalle, mostrándose la inserción identificada de la secuencia del vector binario (región sin ADN-T) o los componentes del ADN-T. Las líneas discontinuas representan casetes contiguos asociados al ADN-T. Las barras rojas indican la secuencia del vector binario (no ADN-T). Las barras de color azul oscuro (LB) y las barras de color gris claro (pea3A(T)) indican el extremo 5' de la construcción de ADN-T (aunque puede estar en orientación 5' o 3' en el genoma de la planta). Las barras de color gris más oscuro adyacentes a las barras rojas son secuencias de relleno y la barra verde azulado representa la secuencia NPTII.

a, Representación esquemática de la eliminación del gen sgRNA del vector No RT. b, ADN-qPCR de ALS en Col-0 (sin transformar) y en plantas T1 transformadas con el plásmido No RT y el plásmido No RT con un gen de sgRNA eliminado. Cada punto representa una planta individual (n = 21 para Col-0, n = 26 plantas T1 individuales para Sin RT y Sin RT, deleciones del gen sgRNA). Las barras horizontales indican la mediana. PCol-0 = 0,00000002, ns = no significativamente diferente (ANOVA de Kruskal-Wallis seguido de la prueba de Dunn). C. Representación esquemática de la eliminación del gen sgRNA del vector ONSEN RT. d. ADN-qPCR de ALS en plantas Col-0 (sin transformar) y T1 transformadas con el plásmido ONSEN RT y el plásmido ONSEN RT con ambos genes de sgRNA eliminados. Cada punto representa una planta individual (n = 22). Las barras horizontales indican la mediana. PCol-0 = 0,00000004, ns = no significativamente diferente (ANOVA de Kruskal-Wallis seguido de la prueba de Dunn). mi. ADN-qPCR de ALS en plantas de tabaco transformadas mediante bombardeo biolístico con partículas recubiertas con ADN plasmídico No RT u ONSEN RT. Cada punto representa una planta individual. Las barras horizontales indican la mediana. ns = no significativamente diferente (prueba U de Mann-Whitney de dos colas). ns, P > 0,05; ****, P < 0,0001.

Datos fuente

a, Alineaciones de secuencias múltiples de uniones entre dos secuencias de ADN-T agrupadas por orientación de las dos secuencias (RB-LB, LB-LB o RB-RB). Las secuencias de referencia se construyeron asumiendo que las moléculas de ADN-T comenzaban y terminaban inmediatamente aguas arriba de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa (VirD2) (5′-CAGGATATATT-3′)63,64. Las secuencias de relleno están en rojo y las secuencias consistentes con deleciones asociadas a microhomología están subrayadas. Si las secuencias de relleno tienen una secuencia similar cerca, ellas (y la secuencia cercana) también están subrayadas. Los asteriscos indican uniones idénticas que ocurren en plantas independientes. b, Representación de uniones de ADN-T con otro ADN-T o secuencia de vector binario que no es inmediatamente adyacente internamente al LB o RB. C. Clasificación de las secuencias RB-LB, LB-LB y RB-RB para cada línea T1 siguiendo un procedimiento previamente descrito65. NHEJ (eliminaciones <4 pb e inserciones <5 pb), inserciones (≥5 pb con cualquier eliminación), no microhomología (No MH; eliminación ≥4 pb o inserciones <5 pb con microhomologías <2) y microhomología (MH ; eliminación ≥4 pb con microhomologías ≥2). Los últimos tres están asociados con la ADN polimerasa theta.

a, ADN-qPCR de ALS en plantas Col-0, atxr5/6 y tsk transformadas con la construcción ONSEN RT. Cada punto representa una planta T1 individual (n = 24). Las barras horizontales indican la mediana. ns = no significativamente diferente (ANOVA de Kruskal-Wallis seguido de la prueba de Dunn). b, ADN-qPCR de ALS en ADN extraído de hojas de plantas T1 a los 16 días y 30 días después de la germinación.

Datos fuente

a. Estructura genética de CRY2. Las barras grises representan exones y las barras azules representan regiones a las que se dirigen los sgRNA. antes de Cristo. Frecuencia INDEL de productos de PCR CRY2 amplificados a partir de ADN extraído de hojas de plantas T1 individuales transformadas con construcciones No RT u ONSEN RT. Las construcciones portaban (b) sgRNA n.° 2 o (c) sgRNA n.° 3. d. ADN-qPCR de ELA en plantas T1 sin indeles CRY2 detectables (Sin indeles) o indeles detectables (Indels) utilizando CRY2 sgRNA #3. Cada punto representa una planta T1 individual (n = 20). Las barras horizontales indican la mediana. *P = 0,0350 (prueba U de Mann-Whitney de dos colas) e. ADN-qPCR de ALS en plantas No RT y ONSEN RT T1 (gris) en relación con el porcentaje de tasas de focalización de genes verdaderos (no ectópicos) en la generación T2 (rojo).

Datos fuente

El modelo se basa en el modelo de integración de ADN-T de Kralemann et al., 20226. La captura cromosómica del extremo 3' de una cadena de ADN-T está mediada por TMEJ. Después de la conversión a un intermedio de ADN-T bicatenario, la captura del extremo 5' del ADN-T se logra mediante la eliminación de la proteína VirD2 de Agrobacterium mediante TDP2 o MRE11. La eliminación de VirD2 mediada por TDP2 crea ADN de extremos romos en el extremo 5' del ADN-T que está ligado al cromosoma mediante NHEJ. Por el contrario, MRE11, que actúa como parte del complejo MRN (MRE11-RAD50-NBS1; cargado en ADN por RAD1725), elimina VirD2 cortando el ADN-T internamente, generando un extremo escalonado en el extremo 5' del ADN-T. La actividad TDP2/NHEJ conduce a una única integración de copia de ADN-T (resultado A), mientras que la actividad MRE11/TMEJ conduce a múltiples resultados (BE), siendo el más simple la captura cromosómica del extremo 5' del ADN-T (resultado B) . Alternativamente, el extremo 5' del ADN-T escalonado puede facilitar el reclutamiento de cadenas de ADN-T adicionales para la ligación, lo que lleva a la concatenación. Es más probable que la captura del extremo 5 'de una cadena de ADN T adicional por TDP2/NHEJ en lugar de MRE11/TMEJ termine el ciclo de concatenación. En este modelo, las características del ADN-T, como las repeticiones de ADN, pueden aumentar los niveles de concatenación al aumentar el número de cadenas de ADN-T disponibles para la integración y/o su accesibilidad. ssDNA: ADN monocatenario. dsDNA: ADN bicatenario. Creado con BioRender.com.

Tabla complementaria 1. Lista de sondas utilizadas para análisis FISH y cebadores.

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Reimpresiones y permisos

Dickinson, L., Yuan, W., LeBlanc, C. et al. Regulación de la edición de genes mediante concatenación de ADN-T. Nat. Plantas (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01495-w

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Recibido: 31 de octubre de 2022

Aceptado: 18 de julio de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01495-w

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